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細(xì)胞培養(yǎng)中的污染監(jiān)控與檢測——支原體

更新時間:2022-03-10  |  點擊率:760

之前的文章中,我們說到如果在養(yǎng)細(xì)胞的過程中,如何判斷細(xì)胞是否被細(xì)菌、真菌感染,以及如何祛除細(xì)菌污染。


還沒看的戳戳下面的鏈接直達(dá)


今天我們來討論一下,細(xì)胞培養(yǎng)過程中的,更難處理的支原體污染。


三、支原體污染


支原體概述:

支原體(mycoplasma)是一類沒有細(xì)胞壁、高度多形性、能通過濾菌器、可用人工培養(yǎng)基培養(yǎng)增殖的最小原核細(xì)胞型微生物,大小為0.1~0.3微米。由于能形成絲狀與分枝形狀,故稱為支原體。


在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,顯微鏡很難捕捉到它們的身影,與細(xì)胞競爭營養(yǎng),影響細(xì)胞生長,最終導(dǎo)致實驗出現(xiàn)偏差。


支原體污染癥狀:

在往期文章中,有介紹過如何鑒定支原體污染的,戳戳下方鏈接一起回顧

DIY判斷細(xì)胞的支原體污染


總結(jié)一下:


支原體污染鑒定:

推薦使用穩(wěn)定可靠的支原體檢測試劑盒,這里以經(jīng)典法試劑盒:Venor®Gem qEP(貨號:11-9025/11-9100/11-9250)為例:


1、樣品制備:

①濃縮:當(dāng)細(xì)胞長至90%時,即可收集上清開始檢測,可對樣品進(jìn)行適當(dāng)濃縮。

注:濃縮僅適用于支原體的完整性,避免濃縮前支原體被破壞(如熱滅活)。


②穩(wěn)定:細(xì)胞培養(yǎng)樣品可能含有豐富的DNA酶,在低溫下也能降解支原體DNA。因而推薦進(jìn)行樣品穩(wěn)定化處理。如果立即進(jìn)行DNA抽提,則忽略這一步。


③DNA 抽提:大量證據(jù)表明,DNA抽提可實現(xiàn)最高的靈敏度。DNA抽提有多種方法,但應(yīng)適合支原體基因組。


我們推薦:

Venor®GeM Sample Preparation kits (貨號56-1010/-1050/-1200)適合手動DNA抽提。


這些DNA抽提試劑盒已經(jīng)過大量驗證,具體流程參見試劑盒說明書。另外Venor®GeM qEP kit包含的內(nèi)控DNA對照,也用于驗證DNA抽提步驟(內(nèi)控原理:已知濃度的細(xì)胞,包含內(nèi)部控制DNA序列,該序列不和現(xiàn)有的任何有機(jī)體序列同源,對檢測的DNA樣品干擾極小。在DNA提取前,將該內(nèi)控細(xì)胞和樣品一起加入細(xì)胞裂解液中,被一起提取出來。和靶點樣品一起進(jìn)行熒光定量PCR實驗,內(nèi)控DNA序列的成功擴(kuò)增提示靶點DNA的提取成功)。


二、試劑制備與PCR


注:具體參數(shù)設(shè)置可點擊閱讀原文,登錄締一*網(wǎng)站進(jìn)行查詢


另外,下列儀器已經(jīng)通過PCR反應(yīng)驗證:


3、結(jié)果分析

FAM通道檢測支原體熒光信號。依據(jù)DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值定量。具體步驟需參考具體qPCR 儀及軟件的功能。我們推薦對包括對照在內(nèi)的每個樣品的擴(kuò)增曲線進(jìn)行評估。

Ct<40為陽性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果。支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號的競爭性抑制。支原體DNA越多,F(xiàn)AM通道信號越高,檢測內(nèi)控對照的HEX通道信號越低。


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